La trama de la serie gira en torno al hospital Mill Health Centre, de la ciudad ficticia de Letherbridge, en las afueras de Midland, al este de Birmingham. Se muestran las historias de vida de los médicos, las enfermeras, y los pacientes que con ellos se atienden, así como también relaciones y temas propios que tienen que ver con el hospital, como los tratamientos médicos, las cirugías o las visitas domiciliarias.

Holby City sigue la vida de los profesionales del departamento médico y auxiliar del Hospital Holby General.